骨髓间充质干细胞移植肝衰竭大鼠CD163和白细胞介素10的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.06.016

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (6): 919-925.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.06.016

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骨髓间充质干细胞移植肝衰竭大鼠CD163和白细胞介素10的表达

袁淑芳¹，胡兰英²，姜涛³，孙丽华¹，郑嵘炅¹，赵锦艳²，张跃新¹

¹新疆医科大学第一附属医院感染病中心，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054；²新疆医科大学第五附属医院，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830011；³新疆医科大学医学动物模型研究重点实验室，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054

修回日期:2013-12-07 出版日期:2014-02-05 发布日期:2014-02-05
通讯作者: 张跃新，博士，主任医师，教授，博士生导师，新疆医科大学第一附属医院感染病中心，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054
作者简介:袁淑芳，女，1972年生，四川省简阳县人，汉族，在读博士，副主任医师，主要从事干细胞治疗肝衰竭研究。
基金资助:
新疆医科大学动物模型研究重点实验室开放课题资助项目(XJDX1103-2012-01)

Effect of bone marrow mesenchymal stem cells transplantation on the expression of CD163 and interleukin-10 in rats with acute hepatic liver failure

Yuan Shu-fang¹, Hu Lan-ying², Jiang Tao³, Sun Li-hua¹, Zheng Rong-jiong¹, Zhao Jin-yan², Zhang Yue-xin¹

¹Department of Infectious Diseases, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; ²the Fifth Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; ³Key Laboratory of Medical Animal Models, Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Revised:2013-12-07 Online:2014-02-05 Published:2014-02-05
Contact: Zhang Yue-xin, M.D., Chief physician, Professor, Doctoral supervisor, Department of Infectious Diseases, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
About author:Yuan Shu-fang, Studying for doctorate, Associate chief physician, Department of Infectious Diseases, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Supported by:
the Key Laboratory Open Topics of Animal Models in Xinjiang Medical University, No. XJDX1103-2012-01

摘要/Abstract

摘要：

背景：研究显示骨髓间充质干细胞具有持久生成肝细胞和胆管细胞的能力，在肝损伤后的修复过程中，参与补充因损伤而减少的肝细胞数量，参与修复因损伤破坏的肝组织结构。

目的：探讨骨髓间充质干细胞移植治疗急性肝衰竭大鼠的疗效以及对急性肝衰竭大鼠血清和肝组织CD163、白细胞介素10表达的影响。

方法：选取60只SD大鼠，腹腔注射D-氨基半乳糖/脂多糖制备急性肝衰竭模型。随机分为2组，骨髓间充质干细胞移植组尾静脉移植第3代骨髓间充质干细胞，对照组尾静脉注射等体积生理盐水。于移植后24，120，168 h收集血清和肝组织标本。

结果与结论：在移植后120，168 h，骨髓间充质干细胞移植组大鼠血清谷丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶活性显著低于对照组(P < 0.05)。骨髓间充质干细胞移植组细胞凋亡指数显著低于对照组(P < 0.05)。骨髓间充质干细胞移植组大鼠血清及肝组织中CD163和白细胞介素10水平与对照组比较明显下降(P < 0.05)，且二者的表达有明显的相关性(P < 0.01)。结果可见骨髓间充质干细胞对急性肝衰竭大鼠有一定的治疗作用，CD163、白细胞介素10的基础水平以及治疗过程中的变化趋势可以在一定程度上反映急性肝衰竭的治疗效果。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

全文链接：

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 骨髓间充质干细胞, 急性肝衰竭, CD163, 白细胞介素10

Abstract:

BACKGROUND: Studies have shown that bone marrow mesenchymal stem cells have the ability to persistently generate hepatocytes and biliary cells, and thus in the repair process of liver injury, replenish the reduced number of hepatocytes due to damage and participate in damaged liver structure.

OBJECTIVE: To investigate the effect of bone marrow mesenchymal stem cells transplantation on acute liver failure and the expression of CD163 and interleukin-10 in rat serum and liver tissue.

METHODS: D-galactose and lipopolysaccharidewere used to make acute liver failure models in 60 Sprague-Dawley rats. Then, the rats were divided into control group and transplantation group. Bone marrow mesenchymal stem cells at passage 3 were injected through tail vein in the transplantation group, and normal saline was injected in the control group. After transplantation 24, 120, 168 hours, serum samples and liver tissues were collected.

RESULTS AND CONCLUSION: After transplantation 120 and 168 hours, the serum alanine transaminase and aspartate aminotransferase activities of the transplantation were significantly lower than those of the control group (P < 0.05). In the transplantation group the apoptotic index was still lower compared with the control group, and the difference was significant (P < 0.05). The levels of CD163 and interleukin-10 in the serum and liver tissue in the transplantation group were decreased significantly compared with the control group (P < 0.05). The results suggested that there were highly significant correlations between CD163 and interleukin-10 (P < 0.01). Bone marrow mesenchymal stem cell transplantation has a therapeutic effect on acute liver failure rats. CDl63 and interleukin-10 play a very important role in the pathogenesis of acute liver failure, which can be used as sensitive serum marker proteins for diagnosis and prognosis of acute liver failure.

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Key words: bone marrow, mesenchymal stem cells, rats, Sprague-Dawley, liver fracture, acute, interleukin-10

中图分类号:

R394.2

袁淑芳，胡兰英，姜涛，孙丽华，郑嵘炅，赵锦艳，张跃新. 骨髓间充质干细胞移植肝衰竭大鼠CD163和白细胞介素10的表达[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(6): 919-925.

Yuan Shu-fang, Hu Lan-ying, Jiang Tao, Sun Li-hua, Zheng Rong-jiong, Zhao Jin-yan, Zhang Yue-xin . Effect of bone marrow mesenchymal stem cells transplantation on the expression of CD163 and interleukin-10 in rats with acute hepatic liver failure[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(6): 919-925.

图/表（结果） 3

2.1 实验动物数量分析 60只SD大鼠均进入结果分析。

2.2 大鼠骨髓间充质干细胞的形态及表型鉴定 原代接种3 d即可见较多细胞贴壁，外观呈纺锤形、长梭形和多角形等(图1A)。7-10 d铺满皿底并呈放射状排列的同心圆状或峰谷样生长，细胞簇搏动呈明显同步性，收缩有力。在细胞生长至80%汇合时，传代培养。传代后的骨髓间充质干细胞仍具有自主收缩的特性(图1B)。第3代骨髓间充质干细胞强表达间充质干细胞特异性标志物CD29(93.4%)，CD90(95.2%)，不表达CD11和CD45 (图2)。

2.3 血清谷丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶活性变化 随着病程进展对照组大鼠血清谷丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶活性逐渐升高，骨髓间充质干细胞移植组大鼠血清谷丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶活性逐渐下降。移植120，168 h后两组的血清谷丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶活性差异有显著性意义(P < 0.05，表1)。

2.4 血清CD163、白细胞介素10水平变化 对照组大鼠血清CD163、白细胞介素10水平随时间的延长、肝功能的恶化而升高。骨髓间充质干细胞移植组血清CD163、白细胞介素10水平随肝功能的好转逐渐降低，在移植后120，168 h与对照组相比差异有显著性意义(P < 0.05，表1)。相关分析发现CD163、白细胞介素10两者呈正相关(r=0.673，P < 0.01)。CD163、白细胞介素10与谷丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶之间均有明显的相关性(图3)。

2.5 病理观察结果及肝细胞凋亡情况 造模后120， 168 h对照组肝小叶结构破坏明显，肝细胞弥漫性坏死，见广泛桥接坏死，汇管区大量炎性细胞增生(图4A，B)；骨髓间充质干细胞移植组炎性细胞浸润明显减少，肝小叶结构逐渐恢复(图4C，D)；TUNEL染色可见对照组有大量阳性着色的凋亡细胞。移植120，168 h后骨髓间充质干细胞移植组细胞凋亡指数分别为(17.90±9.80)%、(14.20±12.04)%，与对照组相比差异有显著性意义(P < 0.05)，见图5和表2。

2.6 大鼠肝组织中CD163、白细胞介素10 mRNA的表达 移植120，168 h后骨髓间充质干细胞移植组肝组织中CD163、白细胞介素10 mRNA的表达水平与对照组相比，差异有显著性意义(P < 0.05，表2)；且二者的表达存在明显的相关性(r=0.816，P < 0.01)。

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引言

急性肝衰竭(acute liver failure, ALF)病情凶险、临床症状复杂、病死率高，治疗仍是医学界的难题^[1-3]。急性肝衰竭发病机制与宿主体内的各种免疫、炎症应答有关，其中巨噬细胞活化及其分泌的多种细胞因子在整个发病机制中起重要作用。感染后炎症因子介导的肝细胞凋亡、坏死是促进急性肝衰竭发展的重要因素，同时机体也通过自身的调节释放抗炎因子，以及抑制免疫来调控炎症反应^[4-7]。近年来骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)移植治疗急性肝衰竭因其具有操作简单、应用灵活、可重复进行、免疫原性弱、治疗费用低等优点得到较快发展，成为继原位肝移植后又一治疗肝功能衰竭的有效方法^[8-9]。国内外多家机构的动物和临床实验均表明，骨髓间充质干细胞移植后，受体的肝功能明显改善，一般状态好转，生存期延长^[10-12]。骨髓间充质干细胞可以分泌多种可溶性细胞因子，具有调节机体免疫和炎症反应的作用，能够阻断树突状细胞的成熟、降低T细胞和NK细胞的免疫应答等作用，被认为是治疗移植物抗宿主病等多种疾病的重要机制^[13-16]。目前研究发现CD163、白细胞介素10在协调体内抗炎与抑炎平衡中起着重要作用。CD163也称血红蛋白清道夫受体(haemoglobin scavenger receptor，HbSR)，可作为单核-巨噬细胞活化的标记，在肝衰竭的发生、发展过程中可发挥抗炎、抗氧化的作用。国外的报道显示药物导致的急性肝功能衰竭时，血清中可检测到可溶性CD163增高，因而可溶性CD163被认为是新的具有诊断意义的炎性疾病血清学标志物^[17-19]。过高的可溶性CD163是判断肝功能衰竭预后的重要指标，有利于早期决定肝移植^[20]。白细胞介素10是一种具多效性的细胞因子，在肝脏炎症、肝纤维化、肝移植后排斥反应及肝脏缺血再灌注损伤等多种肝脏疾病的进程中扮演重要的负反馈角色^[21-22]。研究证实白细胞介素10通过巨噬细胞集落刺激因子诱导单核细胞分化为巨噬细胞时，可显著上调CD163mRNA及蛋白的表达^[23-24]。因此研究急性肝衰竭患者CD163、白细胞介素10水平具有重要意义。为此作者通过建立大鼠急性肝衰竭模型，观察骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠急性肝衰竭的疗效。探讨骨髓间充质干细胞移植对急性肝衰竭大鼠血清和肝组织中CD163和白细胞介素10表达及肝细胞凋亡的影响，以评估其在临床中的意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2012年5月至2013年6月在新疆医科大学医学动物模型研究重点实验室、新疆医科大学科研中心实验室完成。

材料：

实验动物：健康雄性Sprague-Dwley(SD)大鼠60只，3周龄，体质量250-300 g，SPF级，由新疆疾病控制中心动物中心提供，许可证号SCXK新2003-0002。

实验试剂：血清CD163 ELISA试剂盒(上海西唐生物科技有限公司)、白细胞介素10 ELISA试剂盒(ebioscience公司)。

实验方法：

骨髓间充质干细胞的培养：采用全骨髓法分离SD大鼠骨髓间充质干细胞。方法简述如下：大鼠腹腔注射肝素5×10⁴ U，15 min后断颈处死。收集双侧胫股骨中全骨髓，过滤、离心。按1×10⁹ L^-¹的细胞浓度接种于75 cm²培养皿，24 h后换液去除未贴壁的细胞。以后3 d完全换液1次，7-10 d后细胞汇合达80%-90%，用0.25%胰酶消化后1∶3传代。

应用流式细胞仪分析对骨髓间充质干细胞进行表型鉴定。取生长良好的第3代骨髓间充质干细胞，2.5 g/L胰酶消化后，178×g离心7 min，收集细胞沉淀，预冷的PBS洗涤2次，制备1×10⁹ L^-¹单细胞悬液，分别加入 FITC标记的抗鼠CD45，CD29，CD11和CD90抗体(BioLegend公司)，混匀后室温避光孵育15 min，PBS洗涤2次，上机检测。消化收集第3代骨髓间充质干细胞，制成浓度为1×10⁹ L^-¹的细胞悬液，以备用于后续移植实验。

动物模型建立及标本采集：腹腔注射10%D-氨基半乳糖1.4 g/kg(间隔12 h，共注射2次)和0.005%脂多糖 20 μg/kg(共注射1次)制备大鼠急性肝衰竭模型^[5]。60只大鼠随机分为骨髓间充质干细胞移植组与对照组，两组均分为24，120，168 h 3个时间点取材，每个时间点10只。成模后即刻骨髓间充质干细胞移植组经尾静脉进行同种异体第3代骨髓间充质干细胞移植，移植数量为1.4×10⁷/kg。对照组大鼠给予等体积生理盐水尾静脉注射。于移植后24，120，168 h内眦静脉采血、取新鲜肝组织。

生化指标及细胞因子动态变化：血液离心，部分血清采用全自动生化分析仪测定不同时间点大鼠血清谷丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶活性。余血清存放-80 ℃冰箱待测细胞因子水平。血清CD163、白细胞介素10水平应用ELISA方法进行检测。

苏木精-伊红染色与原位细胞凋亡检测：大鼠肝组织石蜡包埋切片，常规行苏木精-伊红染色，光镜下观察组织病理变化。用TUNEL检测试剂盒(Roche Applied Science)检测肝细胞凋亡情况。在阳性标本上以磷酸盐缓冲液代替第一抗体作阴性对照。随机选5个高倍镜视野，每个视野计数100个肝细胞核，计算凋亡细胞百分比的均数，即凋亡指数。

RT-PCR检测CD163、白细胞介素10 mRNA的表达：采用TRIzol试剂盒(Invitrogen)，按说明提取肝组织RNA。CD163、白细胞介素10及内参引物采用Primer Premier 5.0软件设计引物，由上海生工生物工程公司合成。

引物序列：CD163正义序列为5’-GGA TTG CCC TAT GAC TGC TCT-3’，反义序列为5’-TTG GAC CGA AGA TGA TGA ACT AC-3’。扩增产物大小121 bp。白细胞介素10正义序列为5’-CAA CAT ACT GCT GAC AGA TTC CTT-3’，反义序列为5’-TCA TTC TTC ACC TGC TCC ACT-3’，扩增产物大小为249 bp。β-肌动蛋白正义序列为5'-CGT AAA GAC CTC TAT GCC AAC A-3’，反义序列为5’-CGG ACT CAT CGT ACT CCT GCT-3’，扩增产物大小为229 bp。

PCR反应条件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 10 s；60 ℃ 40 s，40个循环；72 ℃ 5 min。使用Stepone plus型荧光定量分析仪(ABI)进行分析，获得产物Ct值。采用相对量2^-^△△Ct法比较CD163、白细胞介素10基因在大鼠肝组织中的表达差异。

主要观察指标：①血清谷丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶活性。②血清CD163、白细胞介素10水平。③病理观察结果及肝细胞凋亡情况。④肝组织中CD163、白细胞介素10 mRNA的表达。

统计学分析：采用SPSS 18.0统计学软件进行统计学处理。计量资料以x(_)±s表示，组间比较采用随机区组设计的方差分析；计数资料采用秩转换后的方差分析；判断是否具有相关性采用Spearman相关分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

目前认为肝脏大面积坏死的机制主要与肝细胞凋亡、微循环障碍等因素有关。其中细胞凋亡是导致肝脏二次打击的重要细胞机制^[25-27]。研究发现骨髓间充质干细胞能通过旁分泌作用，分泌多种细胞因子和生长因子，促进肝细胞再生，抑制炎症反应及细胞凋亡^[28-31]。目前研究显示骨髓间充质干细胞具有持久生成肝细胞和胆管细胞的能力，在肝损伤后的修复过程中，参与补充因损伤而减少的肝细胞数量，参与修复因损伤破坏的肝组织结构，在肝衰竭、肝硬化、肝纤维化等疾病的治疗方面具有良好的应用前景^[32-35]。Parekkadan等^[36]发现骨髓间充质干细胞来源的细胞因子能够防止肝细胞坏死，提高暴发性肝衰竭的生存率。国内刘迎娣等^[37]、郭晓钟等^[38]报道使用骨髓肝细胞移植治疗严重肝病，可以明显改善凝血功能、降低胆红素、改善患者近期生存率。本实验显示骨髓间充质干细胞移植120，168 h后肝组织炎性细胞浸润明显减少，肝小叶结构逐渐恢复，肝细胞坏死、凋亡较对照组明显减轻，大鼠肝功能逐渐恢复。说明骨髓间充质干细胞对急性肝衰竭大鼠具有一定治疗作用。骨髓间充质干细胞移植可以减轻肝组织炎症反应、抑制肝细胞凋亡，从而参与受损肝脏组织的修复过程。

研究表明，急性肝衰竭状态下，机体内毒素血症、巨噬细胞过度活化及多种致炎因子的生成等因素可引起CD163的表达^[39-40]。迄今为止，CD163是仅在单核-巨噬细胞膜上发现的分子。CD163可激活单核巨噬细胞体内的血红素加氧酶1，分解代谢成一氧化碳、铁、胆绿素等，在机体的抗炎，抗氧化以及抗细胞凋亡中发挥作用^[41-42]。CD163能促使巨噬细胞分泌白细胞介素10发挥抗炎反应。白细胞介素10可以上调单核细胞上CD163的表达，减少肝细胞的炎性反应、降低局部炎症因子活性，限制其对肝脏的毒性，减轻肝脏损害^[43]。在D-Gal/脂多糖诱导的肝细胞损伤中，白细胞介素10可下调肝脏局部细胞因子水平，还可抑制淋巴细胞、血管内皮细胞黏附分子的表达，从而抑制肝内粒细胞介导的炎症过程，减轻肝细胞的损伤，间接保护肝脏^[44]。

目前研究显示CD163可以作为肿瘤坏死因子相关弱凋亡诱导因子(TNF-like weak inducer of apoptosis，TWEAK)的受体，与TWEAK结合后通过细胞内吞作用，阻止TWEAK发挥诱导凋亡的生物学功能^[45]。研究表明骨髓间充质干细胞可以通过分泌白细胞介素1受体拮抗剂，抑制前炎症细胞因子的产生，并调控抗炎细胞因子白细胞介素10，减轻肝脏的炎症损伤。白细胞介素10可通过上调FasL和Bax的表达，下调Bcl-2的表达促进肝星状细胞的凋亡^[46]。实验通过ELISA和RT-PCR法检测了CD163、白细胞介素10表达的情况，发现二者的表达趋势相似，随着炎症损伤、凋亡的加重，其表达逐渐增高，提示机体产生抗炎细胞因子CD163、白细胞介素10，对肝脏本身来说是一种保护性防御反应。骨髓间充质干细胞治疗后，大鼠肝功能逐渐恢复，血清及肝组织中CD163、白细胞介素10呈下降趋势，提示骨髓间充质干细胞移植可以降低CD163、白细胞介素10水平，能改善急性肝衰竭大鼠的免疫状况，这可能是骨髓间充质干细胞移植治疗急性肝衰竭的作用机制之一。

急性肝衰竭病情凶险、诊治困难、病死率极高，客观、及时有效地评价急性肝衰竭患者的病情及预后并指导临床治疗显得尤为重要^[47]。Moller等^[48]研究在急性肝衰竭患者血清中可溶性CD163水平较正常对照组升高近10倍，并证实可溶性CD163 > 26 mg/L是急性肝衰竭患者存活与否的最佳分界点，其灵敏度和特异度分别可达62%和81%，认为可溶性CD163水平能反映肝脏炎症的严重程度、与患者预后相关。研究表明，在急性肝衰竭患者血清中可溶性CD163浓度明显高于肝炎肝硬化、慢性乙型肝炎、急性肝炎及正常对照组，并与总胆红素、国际标准化比值呈正相关性，此结论证实增高的可溶性CD163的表达与患者的病情严重程度紧密相关，并提示预后不良，有助于筛选合适的肝移植候选者^[49-50]。而急性肝衰竭患者高浓度的白细胞介素10被证实是可溶性CD163增多的原因之一。

吴会玲等^[50]研究急性肝衰竭者肝组织中CD163阳性细胞较正常组明显增多，其表达上调可以减轻肝组织炎症损伤及氧化应激反应。本实验结果发现，急性肝衰竭对照组大鼠血清及肝组织内CD163、白细胞介素10表达水平明显高于骨髓间充质干细胞移植组，且CD163、白细胞介素10与谷丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶水平有明显的相关性，反映了肝功能的急剧恶化和疾病严重程度。该研究提示CD163、白细胞介素10的基础水平以及治疗过程中的变化趋势可以一定程度上反映急性肝衰竭的治疗效果。

CD163、白细胞介素10有可能成为早期的评估患者肝移植的指标。目前还缺乏针对CD163/可溶性CD163的统一检测标准以及相应的多中心、大样本研究。今后还需要进一步开展深入广泛的研究，明确阐述CD163、白细胞介素10作为肝衰竭评价指标的临床价值，使其在肝衰竭患者病情、治疗效果及预后的评价中发挥重要作用。

骨髓间充质干细胞移植肝衰竭大鼠CD163和白细胞介素10的表达

Effect of bone marrow mesenchymal stem cells transplantation on the expression of CD163 and interleukin-10 in rats with acute hepatic liver failure

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